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[NanoTemper] FAQ : Assay Buffer Composition

작성자 : 관리자

작성일 : 2024. 01. 12

FAQ : Assay Buffer Composition

일반적으로 MST 실험에 사용되는 assay buffer 에는 제한이 없습니다. NanoTemper Technologies에서는 최상의 결과를 위해 MST buffer (50mM Tris-HCl pH 7.8, 150mM NaCl, 10mM MgCl2, 0.05% Tween 20)를 권장합니다. 모든 용액에 detergent 를 추가하는 것을 매우 권장합니다 (예: 0.05% Tween 20 또는 0.1% Pluronic F-127).

일반적으로 시험관 내 생화학적 분석은 단백질의 원래 환경을 모방하기 위해 생리학적 pH에 가까운 조건에서 수행됩니다. Phosphate buffered saline (PBS), HEPES 및 Tris buffer가 가장 일반적으로 사용되는 buffer입니다. 모든 단백질은 다르며 용액 상태를 유지하려면 특정 조건이 필요할 수 있습니다. Interaction 측정에 MST buffer가 최적이 아닌 경우 다른 버퍼 조건을 시도하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 여기에 제공된 정보는 출발점이 될 수 있습니다.

중요한 것은 버퍼 구성이 하나의 MST 실험 전반에 걸쳐 일정해야 한다는 것입니다. Interaction partner 중 하나를 희석할 때 버퍼 그라데이션이 생기지 않도록 주의하십시오.

General buffer composition:
Ca²⁺ 및 Zn²⁺과 같은 2가 이온은 침전을 초래하므로 PBS에 첨가할 수 없습니다. HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 양쪽이온성 완충 시약은 Ca²⁺에 대한 결합이 무시할 정도입니다. 그러나 다양한 조건에서 radical을 형성할 수 있으므로 생화학에서의 산화환원 과정에 대한 연구에서 2가 이온을 첨가하는 것은 피해야 합니다. Tris (2-amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol) 은 1차 amine이므로 알데히드 및 케톤과 Schiff's bases를 형성할 수 있습니다. 이는 다양한 효소 반응(예: mitochondrial monoamine oxidase (MAO), alkaline phosphatases, α-amylases, aminopeptidases)을 억제합니다. 또한 diethylpyrocarbonate (DEPC)를 비활성화하고 Cu²⁺ Ni²⁺, Zn²⁺와 같은 2가 금속 이온과 약간의 Ca²⁺ and Mg²⁺ 을 킬레이트화합니다.

Buffer pH and protein pI:
분자의 등전점(pI)과 동일한 pH에서 특정 분자는 순 전하를 전달하지 않으며 종종 응집되기 쉽습니다. 접힌 단백질의 정확한 pI을 결정하기 어렵기 때문에 detergent를 첨가해도 강한 응집이 줄어들지 않을 경우 buffer pH를 +/- 0.3 단위로 변경하는 것이 좋습니다.

MST analysis in complex bioliquids:
MST 실험은 대체로 buffer 독립적이며 cell lysate, 혈청 또는 전혈과 같은 복잡한 생체액에서도 수행할 수 있습니다. 이러한 경우 MO.Control 소프트웨어의 binding check를 사용하여 target (labeled molecules)이 없는 경우 솔루션의 auto-fluorescence test를 수행하는 것이 중요합니다. 세포 용해에 사용되는 모든 buffer가 생체분자 기능과 호환되는 것은 아니라는 점을 고려하는 것도 중요합니다. 예를 들어, 높은 detergent 농도나 낮은 이온 강도 조건을 사용하면 단백질이 변성될 수 있습니다. 더욱이, 관심 단백질을 안정화하는 데 도움이 될 수 있는 lysis buffer의 높은 염 농도(>200mM)는 interaction을 약화시킬 수 있습니다. 따라서 interaction 연구에는 생리학적 pH 및 염분 농도와 낮은 detergent 농도의 buffer를 사용하는 것이 좋습니다.

Buffer composition in LabelFree experiments:
LabelFree 실험에서는 일반적으로 360 nm의 방출 파장에서 형광을 발휘하는 buffer 성분을 피하십시오. 이는 물로 채워진 capillary를 buffer가 채워진 capillary와 비교하여 쉽게 테스트할 수 있습니다. 참고: buffer에 형광 물질이 포함되어 있지 않은지 확인하기 위해 결합 실험 전에 이 테스트를 수행해야 합니다. 다음은 LabelFree 실험에서 고유한 형광 (intrinsic fluorescence)을 나타내는 몇 가지 일반적인 버퍼 구성 성분 목록입니다.

• Triton-X-100
• Tween 20
• Imidazole
• Proteins with aromatic amino acids (e.g. BSA)
• Some aromatic molecules
• Igepal CA-630 (NP-40)

첨부파일 : FAQ Assay Buffer Composition_V01.pdf

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